免疫磁珠的定义及应用

ipt 2017-7-27 1060

定义

免疫磁珠是发展起来的一项新的免疫学技术,它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体,以免疫学为基础,渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域,其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。


  免疫磁珠应用


1. 免疫磁珠分选

免疫磁珠细胞分选方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。把细胞用超级顺磁性的 MACS MicroBeads (MACS微型磁珠)特异性地标记,磁性标记完后,把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后,滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来,这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。


超顺磁性的MACS MicroBeads 的体积很小,其直径约为50nm,体积约小于真核细胞的一百万份之一,可与病毒的大小相比。标记细胞上的微型磁珠即使在扫描电镜照片上也几乎看不到。磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成。由于微型磁珠的体积极小,所以不会对细胞造成机械性压力,而且使孵育时间短,操作过程快。MicroBeads 形成一个稳定的胶体液,它们在磁场中既不沉淀又不凝聚。微型磁珠的大小和它的组成成份(氧化铁和多糖)使其可被生物降解,且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力,细胞的生理功能也不变。磁珠不需要去除,因此,阳性分选出的细胞(即磁性标记细胞)可立即用于分析和随后的实验。


用MACS 细胞分选系统可以分离出非常纯的细胞群体,而且有极好的回收率和存活率。依据细胞频率和标记表达水平的不同,MACS分离细胞的纯度可达95%-99.9%,回收率>90%。


免疫磁珠法分离细胞原理: 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。


免疫磁珠法分为正选法和负选法: 正选法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞。负选法-磁珠结合不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞,一般而言,负选法比正选法的磁珠用量大。磁珠: 大小在0.1-0.45mm 包被了生产的高质量单抗磁珠已为白细胞亚群的分选所优化 将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液,磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合,通过分离得到的连有磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。磁分离细胞的重要指标是:纯度和得率,这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小(磁性),然而太小的磁珠得率不高,太大的磁珠又会影响细胞活性,也无法直接上流式。


市场上有2种磁性细胞分离系统: Small particles (≈50 nm) - MACS Large particles (1200~4500 nm) -others(如Dynal)  提供的磁株,由Dynal公司提供大小约为200nm为中等大小磁株。小磁珠:优点:对细胞温和,不影响分离细胞的后续培养,可直接上流式检测,不影响散射光 。小磁珠:缺点:需要很强的磁场来分离细胞,分离速度慢,得率不高,需要一次性的分离柱,不能在普通试管进行,成本昂贵。大磁珠:优点:技术简单,分离可在试管中完成,易于增减细胞用量,速度快,得率高,成本低。大磁珠:缺点:对细胞造成机械压力,影响其生物学活性,不利于分离后培养,纯度低,阻塞FCM的喷嘴。


2. 磁珠用于核酸提取

通过对磁珠进行一定的包被(如硅基、氨基、羧基等),从而可以实现对核酸的高通量、自动化提取,这一技术产生于20世纪80年代,已经有了成熟的试剂盒并形成为产业。随着基因检测、个性化给药、产前诊断等的普及,在生物行业各领域都追求高通量、自动化的今天,传统DNA提取方法的局限愈来愈明显,而磁珠法DNA提取的优势则愈来愈明显:


①能够实现自动化、大批量操作,已有96孔的核酸自动提取仪,用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理,符合生物学高通量的操作要求,使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对,这一特点使得传统方法望尘莫及;②操作简单、用时短,整个提取流程只有四步,大多可以在36-40分钟内完成;③安全无毒,不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂,对实验操作人员的伤害减少到最少,完全符合现代环保理念;④磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。


常用的磁珠法DNA提取试剂盒,国外的有Dynal、Qiagen等,国内将磁珠应用于核酸提取的研究起源于02年左右,经过近些年的反复试验,形成了稳定的核酸提取体系,并已被广泛用于一些疾病(如乙肝、丙肝、结核菌)等的定量检测。

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